Purificación y estudio de la actividad enzimática de las superóxido dismutasas glicosomales de "Leishmania infantum"

Abstract

La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria causada por especies del género Leishmania, unos protozoos flagelados que infectan los macrófagos de sus hospedadores vertebrados. Estos parásitos son capaces de sobrevivir al estrés oxidativo del fagolisosoma gracias a un conjunto de enzimas antioxidantes, entre las que se encuentra la superóxido dismutasa (SOD). La SOD es una enzima dimérica capaz de dismutar los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno. En Leishmania, a diferencia del ser humano, las SODs poseen como cofactor un átomo de hierro. Estos parásitos poseen 4 isoformas de la SOD: dos glicosomales (SODB1 y SODB2) y dos mitocondriales (SODA y SODC). Los glicosomas son unos orgánulos que compartimentan una gran variedad de rutas metabólicas en estos parásitos. Algunas de ellas, como la β-oxidación de ácidos grasos, generan especies reactivas de oxígeno (ROS), entre los que se encuentran los radicales superóxido, que son retirados de los glicosomas gracias a SODB1 y SODB2. Algunos autores han demostrado que el knock-down simultáneo de ambas enzimas en Trypanosoma brucei reduce drásticamente la supervivencia de estos parásitos. Por estos motivos, SODB1 y SODB2 podrían ser unas buenas dianas terapéuticas. En este trabajo hemos realizado el clonaje de los genes que codifican las enzimas SODB1 y SODB2 de Leishmania infantum con objeto de expresar estas proteínas unidas a una etiqueta molecular de 6 histidinas que permite su purificación mediante una cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC). Nuestro trabajo permite concluir que la expresión óptima de His6-SODB1 se obtiene tras una inducción de 2 horas a 16ºC. En el caso de His6-SODB2 los mejores resultados se obtuvieron tras 4 horas a 16ºC. Las proteínas SODB1 y SODB2 escindidas de su tag His6 presentaron una pureza de un 97.4% y un 93.9%, respectivamente. Finalmente, se realizó un ensayo de actividad con el que se confirmó que ambas enzimas son funcionales