Nuevos fluoróforos catiónicos intercalantes de ADN como potenciales sondas para esta biomolécula

Abstract

La visualización de los componentes celulares o de los procesos que ocurren dentro de una célula son tareas esenciales en el campo de la química bioanalítica. En los últimos años la detección fluorimétrica de biomacromoléculas se ha posicionado como una de las técnicas clave en esta área de investigación. Se ha observado que muchas sondas permiten la detección selectiva de células o de componentes celulares.1 Las sondas que son capaces de aumentar su intensidad de emisión tras asociarse a ADN o proteínas (light-up probes) son marcadores útiles en el campo de la genómica y proteómica y algunas de sus aplicaciones más relevantes son la tinción de estructuras subcelulares en microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o el marcaje de ácidos nucleicos en electroforesis en gel.2 Los cationes poliaromáticos con un nitrógeno en posición cabeza de puente son una familia de intercalantes de ADN con buenas propiedades de fluorescencia. Se ha observado que en muchos casos la fluorescencia de estos compuestos se ve desactivada tras la intercalación con ADN. Sin embargo, mediante la introducción de sustituyentes arílicos con libertad de giro se pueden obtener moléculas capaces de aumentar su intensidad de fluorescencia tras la intercalación.3,4 Por esto, se ha planteado como objetivo de esta tesis la síntesis y caracterización fotofísica de sondas intercalantes de ADN tipo light-up. Se ha estudiado también la posibilidad de que estas moléculas tengan propiedades antiproliferativas y como agentes para tinción celular. Se han sintetizado un total de 27 cationes heteroaromáticos con un nitrógeno cuaternario en posición cabeza de puente que se han agrupado en tres series para su estudio. La síntesis de los sistemas sin sustituyentes se ha llevado a cabo utilizando la reacción de Westphal como paso clave para la obtención de los sistemas catiónicos que presentan entre 3 y 6 anillos fusionados y la reacción de Suzuki para la introducción de sustituyentes con libertad de giro. Se ha llevado a cabo la caracterización fotofísica de las moléculas obtenidas y se realizaron valoraciones de fluorescencia en presencia de ADN de timo bovino para conocer sus constantes de asociación. Las constantes de afinidad obtenidas varían entre 1,8±0,4 x 104 y 4,5±1,1 x 105 M-1, similares a las obtenidas por otros autores para cromóforos tipo azonia. Con objetivo de conocer el modo de unión así como la orientación del ligando dentro de la molécula de ADN, se han realizado estudios de dicroísmo circular y computacionales, que han permitido establecer el modelo de intercalación de ADN para algunos de los compuestos seleccionados. Se ha observado que algunos de los cationes seleccionados aumentan su intensidad de fluorescencia tras la intercalación. Por último, se han realizado estudios en células vivas para observar una posible aplicación como agente antiproliferativos mediante ensayos de MTT, así como estudios de microscopía confocal para analizar los patrones de tinción dentro de células HeLa, que han demostrado que los compuestos estudiados tiñen distintas estructuras celulares.