Simulaciones atomísticas de la curvatura del ADN: implicaciones para su circularización, la unión de factores de transcripción y su modulación por fármacos antitumorales
Authors
Mills Fernández, AlbertoDirector
Gago Badenas, FedericoDate
2022Affiliation
Universidad de Alcalá. Departamento de Biología de Sistemas; Universidad de Alcalá. Programa de Doctorado en Señalización CelularKeywords
Fármacos-Tratamiento
Métodos experimentales
Document type
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Version
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Rights
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
Access rights
info:eu-repo/semantics/openAccess
Abstract
La trabectedina (Yondelis®) es un potente agente antitumoral de origen marino obtenido por la
compañía española PharmaMar. Esta molécula se une de forma covalente al surco menor del
ADN e induce curvatura de la doble hélice hacia el surco mayor que ha sido estudiada tanto por
métodos experimentales como teóricos. La primera indicación para la que fue aprobada
trabectedina, debido a su inusitada eficacia, fue el liposarcoma mixoide (LSM), un tumor de
tejidos blandos que aparece como consecuencia de la translocación cromosómica
t(12;16)(q13;p11). Esta traslocación da lugar a un factor de transcripción anormal, FUS-CHOP o
TLS-DDIT3, que se comporta como una oncoproteína, impidiendo la diferenciación normal de
los adipocitos y produciendo una proliferación incontrolada de sus precursores celulares. Se han
descrito hasta 12 tipos diferentes de transcritos FUS-CHOP y, curiosamente, se ha comprobado
que el tipo de transcrito presente en el tumor es determinante a la hora de conseguir una
respuesta favorable a trabectedina. Así, los pacientes que presentan las variantes I o II
responden mejor al tratamiento mientras que los tumores que presentan el tipo III son menos
susceptibles. Trabectedina detiene el crecimiento del LSM y actúa como un estimulante de la
diferenciación adipocítica, ya que bloquea la transactivación llevada a cabo por la oncoproteína.
Este hecho extraordinario se ha atribuido a la capacidad del fármaco de producir la separación
de la quimera FUS-CHOP de sus promotores diana y retrasar la formación del mismo complejo
con el tiempo. Ante estos hallazgos experimentales, y sobre la base de los antecedentes de
modelado molecular del grupo de investigación, decidimos intentar dilucidar el mecanismo
mediante el cual la trabectedina logra separar la quimera del ADN. Como sabemos que este
fármaco produce curvatura del ADN hacia el surco mayor al unirse covalentemente en el surco
menor, planteamos la hipótesis de que esta curvatura en regiones promotoras a las que se unen
los transcritos FUS-CHOP es la responsable de impedir el reconocimiento del ADN por parte del
dominio de unión a ADN de FUS-CHOP. Mediante técnicas de modelado y simulación molecular
hemos estudiado: (i) la curvatura intrínseca de diferentes secuencias de ADN que dan lugar a
círculos de doble cadena covalentemente cerrados en ensayos de ligado y circularización, a
través del análisis de los parámetros helicoidales derivados de su secuencia, (ii) la curvatura
inducida en el ADN tras la unión de los dos únicos fármacos descritos (trabectedina y
calicheamicina) que se sabe aumentan la ratio de circularización de determinadas secuencias de
ADN, mediante el análisis de los cambios en los parámetros helicoidales del ADN tras su unión a
la doble hélice, (iii) el papel de la unión de la T4 ADN ligasa empleada en los ensayos de
circularización en la curvatura del ADN. Con toda la información obtenida referente a la unión
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de proteínas y fármacos al ADN y el impacto en su curvatura, hemos propuesto un modelo para
explicar el mecanismo de acción de trabectedina en LSM. Trabectedin (Yondelis®) is a potent anti-tumour agent of marine origin developed by the Spanish
company PharmaMar. This molecule covalently binds to the minor groove of DNA and induces
bending of the double helix towards the major groove, a process that has been studied both
experimentally and theoretically. The first indication trabectedin was approved for, due to its
unprecedented efficacy, was myxoid liposarcoma (MLS), a soft tissue tumour resulting from
chromosomal translocation t(12;16)(q13;p11). This translocation gives rise to an abnormal
transcription factor, FUS-CHOP or TLS-DDIT3, which behaves like an oncoprotein, preventing
normal differentiation of adipocytes and leading to uncontrolled proliferation of their cell
precursors. Up to 12 different types of FUS-CHOP transcripts have been described. Interestingly,
it has been found that the type of transcript present in the tumour is a determining factor when
it comes to achieving a favourable response to trabectedin. Thus, patients with variants I or II
respond better to treatment while tumours with type III are less susceptible. Trabectedin
prevents the growth of MSL and acts as a stimulant of adipocyte differentiation by blocking the
transactivation carried out by the oncoprotein. This remarkable fact has been attributed to the
drug's ability to cause detachment of the FUS-CHOP chimera from its target promoters and delay
the formation of the FUS-CHOP complex over time. Given these experimental findings, and
based on the molecular modelling background of the research group, we decided to try to
elucidate the mechanism by which trabectedin separates the chimera from the DNA. As we
know that this drug causes DNA bending towards the major groove by covalently binding to the
minor groove, we hypothesised that this curvature in promoter regions to which FUS-CHOP
transcripts bind might be responsible for preventing DNA recognition by the DNA-binding
domain of FUS-CHOP. By means of molecular modelling and simulation techniques we have
studied: (i) the intrinsic curvature of different DNA sequences that give rise to covalently closed
double-stranded circles in ligation and circularisation assays, through the analysis of the helical
parameters derived from their sequence, (ii) the curvature induced in DNA upon binding of the
only two drugs described (trabectedin and calicheamicin) that are known to increase the
circularisation ratio of certain DNA sequences, by analysing the changes in DNA helical
parameters after binding to the double helix, (iii) the role of the binding of the T4 DNA ligase
used in circularisation assays on DNA curvature. Based on all the information obtained regarding
protein and drug binding to DNA and the impact on its curvature, we have proposed a model to
explain the mechanism of action of trabectedin in MLS.
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