Detection and characterization of mechanical forces and molecular dynamic rearrangements in collective cell migration

Abstract

Mechanobiology studies the interplay between the cell and its environment to correlate cellular functions with physical forces. Cells have the ability to exert active forces on their surroundings and, in turn, are able to sense and respond to changes in mechanical properties of the extracellular matrix. This bi-directional communication controls many relevant biological processes, such as morphogenesis, tissue repair or cell migration, proliferation, and differentiation. Dysregulation of these highly coordinated mechanisms, results in the appearance of pathological processes such as cancer invasion, chronic wounds, or skin fragility disorders. The inherent difficulty in measuring certain physical quantities such as force, in a biological system, has meant that most advances in this field are due primarily to a deeper knowledge of the biochemical processes that govern these mechanisms. A full understanding of mechanobiology, however, requires a combined study of biological and physical phenomena. In this regard, a variety of techniques have been developed that have provided us with qualitative and quantitative data on the kinematics and dynamics of cell behavior. These methods in turn, are often complemented by theoretical models that decipher and predict biological behavior based on the laws of physics. Nevertheless, in the context of an organism, most tissues acquire a three-dimensional structure, so there is a need for these measurement techniques to be applicable to 3D environments. Much remains to be developed and improved in this direction, as 3D measurement techniques still present many difficulties. The present thesis reports the development of a new 2D force measurement technique based on a flexible structure of known mechanical properties. This cantilever-based force sensor is deformed by epidermal keratinocytes as they migrate, in a wound healing experimental setup. The resultant deflection of the structure is detected over time by image analysis to infer the forces exerted by the cells. According to the results obtained, an active fluid based theoretical model was formulated that represents the fundamental characteristics of the system and predicts the evolution of its behavior. Thereby, we established a reproducible, easy to implement and affordable 2D force measurement tool. On the other hand, the proposed theoretical model, collects the essential ingredients needed to describe how a multicellular tissue modulates the force it exerts depending on the compliance of its external surroundings. One of its most advantageous features is that its reduced complexity allows for easier interpretation and possible incorporation into other more complex models. This measurement technique was subsequently tested in a Kindler syndrome cellular model, which was generated using the CRISPR/Cas9 tool to produce the loss of kindlin-1 expression. The results obtained showed that, in our specific context, the force measurement tool is sensitive enough to detect a difference between the forces and mechanical work exerted by healthy cells and those exerted by cells exhibiting poor adhesion to the substrate. Furthermore, we also studied the distribution of the cytoskeleton and cell adhesions of the migrating monolayer when interacting with the force sensor, to characterize how cells respond to this experimental environment. Future perspectives focus on a deeper molecular and metabolic characterization of the cellular responses upon interaction with a compliant body and the adaptation of the force sensor to a 3D environment.

La mecanobiología estudia la interacción entre la célula y su entorno para correlacionar las funciones celulares con las fuerzas físicas. Las células tienen la capacidad de ejercer fuerzas activas sobre su entorno y, a su vez, son capaces de percibir y responder a los cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular. Esta comunicación bidireccional controla muchos procesos biológicos relevantes, tales como la morfogénesis, la reparación de tejidos o la migración, proliferación y diferenciación celular. La desregulación de estos mecanismos altamente coordinados conduce a la aparición de estados patológicos como las heridas crónicas, procesos invasivos en el desarrollo del cáncer o trastornos de fragilidad de la piel, entre otros. La dificultad que conlleva la medida de ciertas magnitudes físicas como la fuerza en un sistema biológico, ha supuesto que los avances en este campo se hayan debido fundamentalmente a una mayor profundización en el conocimiento de los procesos bioquímicos que gobiernan estos mecanismos. Sin embargo, para llegar a una comprensión completa de la mecanobiología, se requiere un estudio conjunto de los fenómenos biológicos y físicos que están involucrados. En este sentido, se han desarrollado una gran variedad de técnicas que proporcionan datos cualitativos y cuantitativos sobre la cinemática y la dinámica de los comportamientos celulares. Estos métodos a su vez se suelen complementar con modelos teóricos que, basándose en las leyes de la física, descifran y predicen el comportamiento biológico. No obstante, en los organismos, la mayoría de los tejidos adquieren una estructura tridimensional, por lo que es necesario que estas técnicas de medición puedan aplicarse a entornos 3D. En este sentido, todavía hay un amplio recorrido de desarrollo y mejora, ya que las técnicas de medición en 3D siguen presentando muchas dificultades. En el presente trabajo se expone el desarrollo una nueva técnica de medición de fuerzas en 2D, basada en una estructura flexible de propiedades mecánicas conocidas. Este sensor de fuerza es deformado por células epidérmicas (queratinocitos), a medida que migran hacia adelante. La deflexión producida en la estructura se detecta a lo largo del tiempo mediante análisis de imagen, para inferir las fuerzas ejercidas por las células. De acuerdo con los resultados obtenidos, se formuló un modelo teórico basado en fluidos activos que representa las características fundamentales del sistema y predice la evolución de su comportamiento. De este modo, hemos desarrollado una herramienta de medición de fuerzas en entornos biológicos bidimensionales que es fácil de reproducir e implementar y de coste reducido en comparación con otras técnicas. Por otro lado, el modelo teórico propuesto, reúne los ingredientes esenciales necesarios para describir cómo una monocapa de células migratorias modula las fuerzas que ejerce en función de la rigidez de su entorno. Una de sus características más ventajosas de este modelo, es que su reducida complejidad permite una interpretación más fácil y su posible incorporación a otros modelos más complejos. La técnica de medición fue posteriormente testada en un modelo celular de síndrome de Kindler que generamos utilizando la herramienta CRISPR/Cas9 para producir la pérdida de expresión de kindlina-1. Los resultados obtenidos confirmaron que, en nuestro contexto específico, la herramienta de medición es lo suficientemente sensible como para detectar una diferencia entre las fuerzas y el trabajo realizado por células sanas y las ejercidas por células que presentan una deficiencia de adhesión al sustrato. Además, también se estudió la distribución del citoesqueleto y adhesiones celulares de la monocapa migratoria al interaccionar con el sensor de fuerza, para caracterizar cómo responden las células a este entorno experimental. Las perspectivas futuras se dirigen hacia una caracterización molecular más profunda de las respuestas celulares al interactuar con un cuerpo externo flexible y hacia la adaptación del sensor de fuerza a un entorno 3D.