Introducción del sistema CRISPR/Cas9 en "Leishmania infantum"

Abstract

El sistema procariota CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated) ha sido adaptado para desarrollar una técnica de edición genómica con gran especifidad. Este sistema consiste en un RNA guía que conduce a la proteína Cas9 a una secuencia diana dentro del genoma para generar un corte de doble cadena, provocando la deleción de genes o la introducción de etiquetas. En el género de parásitos Leishmania, la complejidad de su genoma ha dificultado la implantación de otras técnicas de ingeniería génica. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 ha demostrado ser eficiente en estos organismos. En 2015, se delecionó por primera vez un gen en el género Leishmania, concretamente enla especie Leishmania major, mediante esta técnica. El objetivo del presente trabajo ha sido la puesta a punto del mismo sistema CRISPR/Cas9 en Leishmania infantum realizando la deleción del gen que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP). Para ello, se transfectaron parásitos portadores del gen de GFP con el vector pTCas9 para conseguir una expresión de la proteína Cas9. Por otra parte, se modificó un vector, pLS, el cual expresaba el RNA guía y contenía un “cassette” donador de DNA que confiere resistencia a puromicina a los parásitos con el gen de GFP delecionado. Este vector se transfectó en los parásitos bajo cuatro condiciones diferentes: 100 μg y 15 μg de vector circular y 100 μg y 15 μg de vector lineal. Mediante citometría de flujo, determinando la fluorescencia de los parásitos, se observó una disminución de parásitos con expresión de GFP, lo que indicó que el gen había sido delecionado. De las cuatro condiciones utilizadas, la única condición eficaz fue la transfección de 100 μg de vector pLS circular. Este sistema ha demostrado no ser 100% eficaz por lo que es necesario el aislamiento de parásitos con el gen de GFP delecionado