Identificación de biomarcadores mediante técnicas de proteómica cuantitativa para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de células renales

Abstract

INTRODUCCIÓN: en la actualidad no existe ningún marcador molecular con utilidad clínica en el carcinoma de células renales (CCR). La identificación de biomarcadores tiene utilidad directa tanto en el diagnóstico y pronóstico como en la respuesta al tratamiento. Los resultados obtenidos en los trabajos previos son dispares, y las propuestas de marcadores moleculares no se han llegado a validar. La proteómica permite el estudio a gran escala de la estructura y función de las proteínas, y sus cambios bajo la influencia de perturbaciones biológicas. Ofrece, como ventaja con respecto a los estudios genéticos, información sobre la expresión concreta de los genes, así como de los posibles cambios postraduccionales. La mayor parte de los estudios de marcadores en tejido utilizan, como referencia frente al CCR, tejido sano del mismo órgano (en adelante “NT”). No obstante, no se ha analizado, hasta la fecha, si ese tejido se puede considerar verdaderamente sano. HIPÓTESIS: las técnicas de proteómica cuantitativa pueden permitir el análisis de muestras de CCR y de tejido “NT”, identificando concentraciones diferenciadas de proteínas en diferentes tipos de muestras, así como aportando información de las rutas metabólicas alteradas. La comparación del tejido “NT” con otro tejido sano, mediante estas técnicas, permitiría conocer posibles cambios proteómicos presentes en ese tejido debido a modificaciones en el microambiente peritumoral. OBJETIVOS: describir el proteoma de dos tejidos de referencia diferentes, el tejido “NT” y tejido de riñón de donación de órganos (en adelante “Control”), así como analizar sus diferencias metabólicas y proteicas. Describir el proteoma del CCR tipo células claras (CCRcc) y compararlo con los tejidos de referencia y con otro tipo de CCR, el cromófobo (CCRcr). Proponer una firma de proteínas como posibles biomarcadores del diagnóstico del CCR. MATERIALES Y MÉTODOS: se realizó un estudio cuasiexperimental de comparación y obtención de datos transversal. Se incluyeron muestras tisulares en cuatro grupos diferentes: muestras de CCRcc (de 12 pacientes), muestras “NT” (de 12 pacientes), muestras de CCRcr (de 4 pacientes) y muestras “Control” (de 17 pacientes). Mediante técnica iTRAQ (isobaric tags for realitive and absolute quantification), se analizaron los cuatro grupos, identificando diferencias en las concentraciones de proteínas de forma relativa. Se consideraron significativas las diferencias con un ratio superior a 2. Posteriormente se realizó un análisis bioinformático de la función y metabolismo en el que esas proteínas estaban implicadas. RESULTADOS: se identificaron 3900 proteínas en el estudio. En la comparación entre “NT” y “Control” se evidenció que ambos tejidos presentan grandes similitudes. Sólo 23 proteínas presentaron diferencias significativas entre ambas muestras. Se comprobó que “NT” está sometido a cambios inflamatorios y de respuesta de fase aguda muy llamativos. Destacan la elevación de proteínas de la cascada de reacción de fase aguda, como haptoglobina, apolipoproteínas, proteínas del complemento y fibrinógeno. La comparación de CCRcc frente a los dos tejidos de referencia mostró grandes diferencias. Destacaron los cambios en la producción de energía celular, en la matriz extracelular y en el metabolismo lipídico. En cuanto al primero, se apreció que en CCRcc la respiración celular se realiza fundamentalmente por la vía de la glicólisis en detrimento del ciclo de Krebs (mitocondrial), como expresión de la activación de HIF1α, destacando la elevación de enolasa. En cuanto a la remodelación de la matriz extracelular, se apreció una activación de la transición epitelio-mesenquimal, destacando la elevación de metaloproteasa 9, fibronectina, periostina y trombospondinas 1 y 2. En cuanto a los cambios en el metabolismo lipídico, se apreció una disminución generalizada del mismo en el tejido CCRcc. Las proteínas más destacables de este grupo fueron la elevación de FABP7 y perilipina, y la disminución de FABP1. La comparación entre CCRcc y CCRcr mostró que en CCRcr no está tan suprimida la respiración mitocondrial. Destacó la elevación de NNMT en CCRcc. CONCLUSIONES: este estudio es el que más proteínas ha identificado en un análisis sobre CCR. Las rutas de actividad inflamatoria y respuesta de fase aguda están más activadas en “NT” que en “Control”. El tejido CCRcc presenta una elevación de la vía de la glicólisis en detrimento del ciclo de Krebs. Así mismo, desarrolla modificaciones de la matriz extracelular en relación con la invasión y diseminación tumoral, y una disminución global del metabolismo lipídico. Las proteínas que más potencial tienen como posibles biomarcadores diagnósticos de CCR son la elevación de enolasa 2, galectina, metaloproteasa 9, periostina, fibronectina, trombospondinas 1 y 2, FAPB7, perilipina 2, NNMT y haptoglobina, así como la disminución de FABP1.

INTRODUCTION: to date, there is not a biomarker useful in renal cell carcinoma (RCC). Biomarkers have a potential role in diagnosis, prognosis and response to treatment. Results from literature are varied, and there is no a validated panel of possible biomarkers. Proteomic is the large-scale study of the structure and function of proteins, and their changes under the influence of biological disturbances. Unlike genetic studies, proteomics offer information about the real expression of genes, and possible postranscriptional changes. Until now, publications searching biomarkers have used adjacent healthy kidney tissue from organs with RCC (“AKT”) as references to the malignant tissue, but there is no studies comparing “AKT” with tissues from kidneys without tumour. HYPOTHESIS: proteomic techniques can analyze tissues of RCC and “AKT”, identifiyng changes in expression of proteins and metabolomic differences. Comparison of “AKT” with tissue from kidneys donated to renal transplantation (“Control”) with proteomic techniques could offer information about eventual changes in peritumour microenviroment. OBJECTIVES: to describe “AKT” and “Control” proteome, their differences in protein expression and their metabolic changes. To describe clear cell RCC (ccRCC) proteome, and metabolic and proteomic differences with “AKT” and “Control”. To identify proteomic and metabolic differences between ccRCC and cromophobe RCC (crRCC). To propose a panel of potential biomarkers for the diagnosis of RCC. METHODS: this was a quasi-experimental study with a transversal data obtaining. There were included tissues from four different groups: ccRCC tissue (12 patients), “AKT” ccRCC tissue (12 patients), crRCC tissue (4 patients) and “Control” tissue (17 patients). Using iTRAQ (isobaric tags for realitive and absolute quantification) technique, there were identifyed differences in proteomic expression between these groups, considering significant differences over a ratio of 2. A bioinformatic analysis of these results was performed, identifying metabolomic changes. RESULTS: there were identified 3900 proteins. “AKT” and “Control” were very similar tissues, and only 23 proteins differ significatively between them. “AKT” showed an important overactivation of inflammation pathways, including acute phase response pathway, from “Control” tissue. Haptoglobine, complement proteins and fibrinogen highlighted in this differences. ccRCC was very different from “AKT” and “Control”. The most important differences were cellular respiration, extracellular matrix remodelation and lipid metabolism. Due to activation of HIF1α, there was a overacitvation of gycolysis pathway at the expense of a suppression of mitochondrial activity (citric acid cycle - TCA), with an increment of enolase. Regarding extracellular matrix remodelation, there was an activation of epitelial – mesenchymal transition, with an overexpression of matrix metalloprotease 9, fibronectin, periostin and thrombospondin 1 and 2. There was a decrease of lipid metabolism, emphasizing a low level of FABP1, but with an increase of FAPB7 and perilipin 2. crRCC, compared to ccRCC, had more mitochondrial activity and less expression of glycolysis pathway. It is remarkable in this comparison an increase of NNMT in ccRCC from crRCC. CONCLUSIONS: this is the study with the higher number of identifiyed proteins to the date. “AKT” tissue has an increase of inflammation pathways in comparison with “Control” tissue. ccRCC tissue has an increase of glycolysis pathway and a decrease of TCA cycle. ccRCC tissue has an important activity of extracellular matrix remodelation, related to tumour invassiveness and dissemination, and a decrease of lipid metabolism. The most promising eventual biomarkers to the diagnosis of RCC are the elevation of enolase 2, matrix metalloprotease 9, fibronectin, thrombospondin 1 and 2, FABP7, perilipin 2, NNMT and haptoglobin, and the decrease of FAPB1.