Estudio del mecanismo de recombinación homóloga en cereales y caracterización de genes implicados en el proceso

Abstract

En el presente trabajo se han estudiado diferentes aspectos relacionados con los procesos de recombinación homóloga en cereales, concretamente en trigo y cebada. Se pretende así acercarse al objetivo de poder llevar a cabo gene targeting en estas especies de elevado interés agroeconómico. Partiendo del conocimiento de que los procesos de recombinación homóloga son favorecidos tras la rotura de la doble cadena de ADN cuando se encuentran próximas secuencias homólogas (Puchta y col., 1993), se ha trasladado a trigo y cebada un estudio ya llevado a cabo en plantas modelo como son Arabidopsis y arroz. Este estudio requiere la obtención de plantas transgénicas portadoras de las construcciones delatoras y de una construcción con el gen para la enzima de restricción ISce-I. Por ello, parte de este trabajo también ha consistido en la puesta a punto de técnicas de transformación de embriones inmaduros de trigo y cebada mediante infección con Agrobacterium. Por otro lado se planteó el estudio de un sistema implicado en los procesos de recombinación homóloga, eligiéndose para ello el complejo MRN, como un importante sistema que participa tanto en procesos de recombinación homóloga como de recombinación ilegítima, en la detección y procesamiento de las roturas DSB, en meiosis, en el mantenimiento de telómeros y en la activación de puntos de control del ciclo celular en respuesta a roturas DSB. Este complejo está formado por los productos de tres genes, Mre11, Rad50 y Nbs1. Se propuso llevar a cabo una caracterización de los tres genes (Mre11, Rad50 y Nbs1) en trigo. También se ha localizado mediante FISH los loci para el gen Rad50 en trigo. Además de la obtención de las secuencias genómicas y de ADN copia en todos los casos, se han llevado a cabo ensayos de expresión que han permitido comparar la expresión de los distintos genes entre las especies empleadas para el estudio, relacionándolo con el distinto nivel de ploidía que presentan, así como estudios de expresión relativa de los genes homeólogos. Por último se han realizado estudios de interacción de las proteínas MRE11, RAD50 y NBS1 mediante ensayos de doble híbrido en levaduras. Han formado parte de este trabajo la puesta a punto de técnicas, como en el caso de la localización mediante FISH de genes de copia única en trigo, empleando para ello un sistema de amplificación de la señal, Tyr-FISH. Para el estudio de expresión relativa de los genes homeólogos se ha realizado una modificación de la técnica SSCP (Cronn y Adams, 2003), sustituyendo el uso de radiactividad por fluorescencia, y consiguiendo una simplificación de la técnica, y una mayor precisión en la obtención y análisis de los resultados.