Replicación viral y producción de óxido nítrico y malondialdehído en cultivos celulares y ratones tratados preventivamente con melatonina, minociclina y ácido ascórbico infectados por el virus de encefalitis equina venezolana

Abstract

El virus de Encefalitis Equina Venezolana (EEV) ha causado extensas epidemias a lo largo de América del Sur, sobre todo en Venezuela. Afecta, con una alta morbilidad, el sistema nervioso central (SNC) en humanos y equinos. Existen sustancias antioxidantes que interactúan con los radicales libres retardando la oxidación; entre ellas se encuentran la Melatonina (MLT), la Minociclina (MIN) y el Ácido ascórbico (AA). Se plantea determinar el efecto in vitro e in vivo de la MLT, MIN y AA sobre la replicación viral, producción de Óxido nítrico (NO), y Malondialdehído (MDA) en cultivos celulares y ratones infectados por el EEV. En los ensayos in vitro se utilizaron células de neuroblastoma múrido (Na2) las cuales recibieron tratamiento preventivo individual y combinado de MLT en dosis de 0,5 mM, 1,0 mM y 5,0 mM 30 minutos antes de la infección, en la MIN se utilizaron dosis de 0,1 [my]M, 0,2 [my]M y 2,0 [my]M 30 minutos antes de la infección y de AA dosis de 25,0 [my]M, 50,0 [my]M y 75,0 [my]M 1 hora antes de la infección viral. La infección con el virus de EEV se realizó a una concentración de 1x10-6 UFP/ml en atmosfera de 5% de CO2 y a 37°C. Se tomaron sobrenadantes para determinar NO, MDA, títulos virales a las 24 h post-infección. Los ensayos in vivo se realizaron en ratones NMRI albinos los cuales recibieron tratamiento preventivo individual y combinado por vía subcutánea con 500 [my]g de MLT/Kg de peso, 50 mg de MIN/Kg de peso y 50 mg de AA/Kg de peso, 3 días antes de la infección viral. Los ratones fueron inoculados intraperitonealmente con la cepa Guajira (E-100) del virus de EEV según el protocolo experimental. Los animales fueron sacrificados los días 1ero, 3ero y 5to post-infección, cinco para cada grupo experimental por cada ensayo. Se extrajo sangre completa por punción del seno orbital para la obtención del suero para la determinación de anticuerpos IgM anti EEV, concentración de NO mediante la Reacción de Griess y MDA por el método colorimétrico del ácido tiobarbiturico. Posteriormente, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical para la obtención de sus cerebros, previa perfusión intracardiaca y realizar la determinación de los títulos virales por la técnica de plaqueo, NO y MDA. En los cultivos celulares infectados in vitro, se observó una disminución de la producción de NO, MDA, así mismo; se evidenció un efecto sinérgico al utilizarlos en combinación. Estos efectos no fueron dosis dependiente. Por otro lado, se evidenció una disminución de la replicación viral en las células Na2 al ser tratadas con los fármacos. En los homogeneizados cerebrales y el suero de animales consecuentemente a la infección viral, se observó un incremento en la generación de NO (p<0,001) además de la elevada producción de MDA, los cuales disminuyeron sus niveles al ser tratados con MLT, MIN y AA y las combinaciones MLT y MIN y MIN y AA. En conclusión, el tratamiento preventivo con MLT, MIN y AA disminuye en el modelo experimental in vitro de infección por EEV los títulos virales en los cultivos celulares, en homogeneizados cerebrales y suero del modelo múrino in vivo de infección por EEV, siendo la combinación MLT y MIN la más eficaz, A su vez, el tratamiento preventivo con MLT y AA pero no con MIN, provocó una disminución en la producción de NO y MDA en modelos experimentales de la infección por EEV in vitro e in vivo, siendo la combinación MLT+MIN la más eficaz. Tomados globalmente estos resultados apoyan el desarrollo de estrategias terapéuticas preventivas de la EEV siendo la MLT el candidato preferente por su elevada tolerancia.