%0 Journal Article %A Rico Vidal, Eva %T Estudio de la nucleasa EndoG en el protozoo "Leishmania infantum": caracterización e implicaciones en la supervivencia y muerte del parásito %D 2010 %U http://hdl.handle.net/10017/9606 %X En los últimos años, ha sido demostrado y aceptado que organismos unicelulares como los parasitos del género Leishmania son susceptibles de sufrir procesos de muerte celular que recuerdan a la apoptosis descrita en metazoos, y que pueden ser inducidos por una amplia variedad de estímulos. Sin embargo, los mecanismos moleculares que participan y regulan este proceso todavía son bastante desconocidos y se han descrito pobremente. Además, las moléculas que podrían participar en dichos procesos todavía no han sido identificadas. Debido a que la degradación del ADN es probablemente el evento más caracterizado durante el proceso similar a apoptosis que tiene lugar en Leishmania, nos hemos centrado en identificar a la nucleasa responsable de dicha degradación. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que los promastigotes de Leishmania infantum expresan una nucleasa similar a las Endonucleasas G de eucariotas superiores que, de acuerdo con la predicción para su estructura, pertenece a la superfamilia de nucleasas con dominio ββα de unión a metal. El pH óptimo y los requerimientos catiónicos de la EndoG de L. infantum recuerdan a los determinados previamente para otras EndoGs. Además, la nucleasa del parásito procesa cada hebra de ADN de forma independiente, al igual que se ha descrito para sus homólogas en otros organismos, y muestra, al igual que la nucleasa Nuc1p de levaduras, actividad endo-exonucleasa. La actividad de la proteína recombinante puede ser además inhibida por la acción del ácido aurín-tricarboxílico (ATA), que es un clásico inhibidor de nucleasas, y por el agente reductor β-mercaptoetanol. Este último resultado se debe probablemente a la presencia de un puente disulfuro entre los residuos de cisteína 100 y 116. La actividad de esta nucleasa se puede inhibir también por la acción del análogo de timidina LEI-49, que muestra una mayor actividad anti-Leishmania frente a parásitos que sobre-expresan EndoG que frente a parásitos silvestres. La EndoG de L. infantum contiene un péptido señal que causa su translocación a la mitocondria, donde se localiza en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, ante un estímulo de muerte como el tratamiento de los parásitos con edelfosina o miltefosina, la nucleasa es liberada de la mitocondria y se transloca hasta el núcleo, donde interviene en la degradación del ADN que tiene lugar durante el proceso apoptótico. Nuestros resultados también demuestran que la sobre-expresión de la proteína en parásitos tratados con edelfosina o miltefosina, causa un incremento significativo en el porcentaje de parásitos TUNEL positivos, pero no conlleva ningún efecto en condiciones normales de crecimiento. Por otro lado, parásitos que expresan niveles de proteína más bajos de lo normal crecen en menor medida que los parásitos silvestres y son más resistentes ante un estímulo de muerte, produciéndose una disminución del porcentaje de parásitos TUNEL positivos tras tratamiento con edelfosina con respecto a los parásitos silvestres. Análisis mutacionales revelan que los aminoácidos presentes en el centro catalítico de la nucleasa tienen diversa relevancia en su actividad catalítica. Así, mientras que la H214 y la R212 parecen fundamentales para la actividad de la enzima debido al papel que desempeñan en el ataque nucleófilo y en el reconocimiento de sustrato, respectivamente, la S211 no parece ser fundamental para la correcta arquitectura del sitio catalítico. Finalmente, hemos identificado un dominio putativo de auto-inhibición en la EndoG de L. infantum, que podría estar implicado en la regulación de la actividad catalítica de la misma. %K Leishmania donovani infantum %K Leishmaniosis-Aspectos moleculares %K Biología molecular %K Ciencia %K Biología %K Biology %K Microbiología y parasitología %K Microbiology and parasitology %K Ciencias de la salud %K Patología %K Pathology %~ Biblioteca Universidad de Alcala